Analýza srovnávacích údajů o charakteristice průběhu brucelózy umožňuje konstatovat, že brucelóza u lidí je v posledním desetiletí méně zjevná, což komplikuje její diagnostiku. V takových případech zůstávají laboratorní metody pro studium této infekce extrémně relevantní. To zdůrazňuje potřebu zlepšit a vyvinout nové, citlivější a specifičtější diagnostické nástroje, zejména ty, které zahrnují rychlé testování a přístrojové zaznamenávání výsledků testů. Byl vyvinut diagnostický testovací systém pro detekci specifických protilátek proti původci brucelózy metodou nepřímé enzymové imunoanalýzy při studiu biologického materiálu od lidí a optimalizovány podmínky pro jeho realizaci. Jsou prezentovány výsledky ukazující na dostatečně vysokou specificitu a senzitivitu testovacího systému, což umožňuje jeho navržení pro rutinní diagnostiku brucelózy jako doplňkový nebo alternativní test.
diagnostika
testovací systém
1. Afanasyev E. N. Srovnávací charakteristiky antigenní struktury bakterií rodu Brucella: diss. … kandidát med. vědy. – Stavropol, 1983. – 173 s.
2. Konstrukce diagnostického testovacího systému pro detekci protilátek proti původci brucelózy v nepřímé enzymové imunoanalýze / S. A. Kurcheva, O. L. Startseva, A. A. Semircheva, E. V. Krinitsyna // Aktuální problémy epidemiologie a preventivní medicíny: materiály VI Všeruského vědeckého a praktického výzkumu organizací mladých vědců a odborníků Rosnad22 24), 2014. – S. 2014-127.
3. Krinitsyna E. V., Kryukova O. S. Reagenční soupravy ZAO Vector-Best pro sérologickou diagnostiku brucelózy // News of Vector-Best. – č. 4 (70). – 2013: http://www.vector-best.ru/nvb/n70/st70_1.htm ; Datum přístupu: 06.11.14.
4. Posouzení imunitního stavu a diferencovaná imunokorekce u brucelózy / G. M. Kurmanova, A. K. Duisenova, K. B. Kurmanova, N. Kh. // Metodická doporučení. – Almaty, 2002. – 30 s.
5. Vývoj a optimalizace podmínek pro nastavení testovacího systému pro diagnostiku vztekliny pomocí sendvičového enzymového imunosorbentního testu na pevné fázi / E. S. Zhilin, Zh K. Koshemetov, V. M. Matveeva, A. T. Tatybaeva [Elektronický zdroj]. – Režim přístupu: http://flatik.ru/es-jilin-jk-koshemetov-vm-matveeva-at-tatibaeva (datum přístupu: 02.03.2016).
6. Tyumentseva I.S., Afanasyev E.N., Efremenko V.I., Bazikov I.A., Alieva E.V. Metoda získávání diagnostického séra // Patent na vynález č. 2135210. – 1999.
7. Yasneva E. A., Konstantinov A. V. Optimalizace podmínek pro nastavení nepřímé varianty enzymové imunoanalýzy pro stanovení protilátek proti kmenům „BK“ a „K“ viru Aujeszkyho choroby v krevním séru prasat // Veterinární patologie. – 2007. – č. 4. – S. 51–55.
Brucelóza je bakteriální infekčně-alergické onemocnění, které patří do skupiny zoonóz a mezi ostatními infekčními chorobami zaujímá zvláštní postavení pro jedinečnost původce onemocnění. Etiopatogenetické rysy brucelózy určují větší tendenci onemocnění přecházet do chronicity při dlouhodobém přetrvávání patogenu. Časový faktor nehraje absolutní roli při určování formy nebo stádia onemocnění, protože akutní proces se může vyvinout na pozadí latentní brucelózy a chronický průběh se může vyvíjet od samého počátku onemocnění. Zpravidla se po konzultaci s infekčním specialistou pro vyloučení případné brucelózy vyšetřuje krev pacienta pouze u Heddelsonovy a Wrightovy reakce, které mají podle řady autorů nízkou senzitivitu (35–64 %). Z moderních sérologických metod diagnostiky brucelózy je nejdostupnější a nejrozšířenější enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) [2, 3, 4]. Zjevnými výhodami tohoto testu jsou jednoduchost a rychlost provedení, vysoká citlivost, stabilita reagencií, možnost kvantitativního účtování reakce, zpracování velkého množství vzorků, automatizace procesu a objektivita instrumentálního účtování výsledků [5]. Metoda enzymové imunoanalýzy se neustále vyvíjí. Na jedné straně se rozšiřuje počet výzkumných objektů, na druhé straně se prohlubují a zdokonalují metody vlastní analýzy [7]. Specifičnost a senzitivita testu ELISA závisí na kvalitě použitých imunoreagentů a optimalizaci nastavení testu.
Cílem této práce bylo studovat možnost detekce protilátek v lidském krevním séru při chronické brucelóze pomocí enzymové imunoanalýzy.
Po analýze získaných výsledků jsme zkonstruovali experimentální diagnostický testovací systém pro detekci specifických protilátek v krevním séru pacientů s akutní a chronickou brucelózou metodou nepřímého enzymového imunoanalýzy (ELISA).
Materiály a metody
Jako senzibilizační činidlo byl testován polyvalentní ve vodě rozpustný antigen brucelózy (Ag-v/r), extrahovaný metodou E. N. Afanasyeva ze směsi bakterií Brucella (B.) abortus19ABB. melitensisRev-1, B. suis61, dezinfikováno acetonem ochlazeným na minus 20 °C [1].
Pro získání králičího séra proti lidskému IgG byla provedena hyperimunizace podle schématu vyvinutého I.S. Tyumentsevovou a spoluautory [6]. Schéma je založeno na výběru optimální kombinace intaktního a polymerizovaného IgG izolovaného z normálního lidského krevního séra, stejně jako imunomodulátorů thymalin a cyklofosfamid. Jako dárci protidruhového IgG byli použiti králíci činčily o hmotnosti 3–3,5 kg. Hyperimunizace byla provedena v souladu s druhovou identitou antigenů a typem producentů za použití IgG izolovaného z normálního lidského krevního séra a imunomodulátorů thymalin a cyklofosfamid.
Konjugace králičích protilátek proti lidskému IgG s indikátorovým enzymem křenová peroxidáza (HRP) (typ VI-A, Rz: ~3.0 s aktivitou 1550 jednotek/mg (Sigma)) byla provedena metodou oxidace jodistanem podle PK Nakane, A. Kawaoi (1974) v modifikaci MB Wilson1978 PK Nakane.
Výsledky ELISA byly zaznamenány pomocí fotometru Multiskan FC, měřením optické hustoty (OD) pomocí filtru s vlnovou délkou 450 nm. Na základě výsledků OP byla vypočtena hodnota kritické optické hustoty (ODcrit.) pomocí vzorce 1:
OPcrit. = OPsr K- + 0,2 (1),
kde OPsrK- je průměrná hodnota OD pro negativní kontrolní vzorek.
K interpretaci výsledků studie byl použit koeficient pozitivity (PC):
CP = OPissl. sérum/OPcrit. (2).
CP ≥ 1,0 – výsledek je pozitivní.
Pro stanovení diagnostické hodnoty zkonstruovaného testovacího systému bylo použito krevní sérum od nemocných a zdravých lidí.
Pevná fáze byla vyrobena z polystyrenových tablet od Costar (USA).
Výsledky a diskuse
Hlavní parametry ELISA, jmenovitě citlivost, přesnost a reprodukovatelnost, se mohou výrazně měnit při změně experimentálních podmínek (teplota, iontová síla a pH reakčního média, koncentrační poměry složek a doba jejich interakce). To určuje potřebu optimalizace každé fáze analýzy, pro kterou byl použit empirický výběr testovacích parametrů.
Při tvorbě diagnostického testu je důležitým bodem stanovení jeho antigenního složení a podmínek adsorpce na pevnou fázi, tedy stanovení optimální koncentrace antigenu (Ag), složení senzibilizačního pufru, podmínky pro vymytí nenavázaných složek, doba a teplota vazby Ag na povrch polystyrenových desek. Optimální senzibilizační dávka bakteriálního agens byla stanovena v sérii experimentů s krevním sérem pacientů s brucelózou a zdravých lidí proti konjugátu imunoglobulin peroxidázy. V experimentech byly testovány různé koncentrace Ag v rozmezí 10÷300 μg/ml. Proces adsorpce Ag byl hodnocen podle intenzity reakce s kontrolním lidským krevním sérem. Nejoptimálnější úrovně nasycení povrchu ploténky bylo dosaženo při koncentraci proteinu 100 μg/ml, přičemž séra zdravých lidí reagovala negativně.
Pro stanovení optimálních podmínek pro senzibilizaci Ag-v/r destičky byla posuzována intenzita reakce během inkubace v termostatu (37±1) °C po dobu (3, 2, 1 h) a za použití termotřepačky při stejné teplotě (250 ot./min.), jakož i 18 h při teplotě 4 °C (obrázek 1). Byl stanoven optimální režim – při teplotě 37 °C po dobu 2 hodin nebo za podmínek termotřepačky po dobu 1 hodiny, zatímco v jiných dobách výdrže je adsorpční kapacita Ag-v/r i specifičnost reakce poněkud nižší. Inkubace při teplotě 4 °C je možná za určitých podmínek pro výpočet reakční doby bez ztráty citlivosti a specificity.
Obr.1. Závislost CP na změnách inkubačních podmínek
Aby se vyloučily nespecifické reakce na imunitní komplex Ag-Ab, byly provedeny studie ke snížení „interference na pozadí“ s použitím hovězího sérového albuminu (BSA) a kaseinu v koncentraci 0,05–1,0 % v pufru pro ředění lidských krevních sér a konjugátu imunoglobulin peroxidázy. Bylo zjištěno, že je vhodné blokovat volná vazebná centra 0,1% roztokem BSA v PBS pH 7,2±0,2 s přídavkem neiontového detergentu Tween 20 až do 0,05%.
Dále byly studovány vlastnosti interakce experimentálního krevního séra se specifickým Ag-v/r imobilizovaným na povrchu polystyrenu v rozmezí od 15 do 90 min při teplotě 37 °C a imunoperoxidázovém konjugátu (15; 30 a 40 min). Jak ukazuje graf (obrázek 2), optimální doba inkubace pro séra je 60 minut a pro inkubaci konjugátu imunoperoxidázy je 30 minut. V kratším časovém úseku nedochází k účinné interakci reakčních složek a prodloužení doby inkubace nejen prodlužuje reakční dobu, ale také přispívá ke vzniku zbarvení pozadí.
Rýže. 2. Závislost hodnot CP na inkubační době séra a konjugátu imunoglobulin peroxidázy
Důležité pro provádění ELISA je stanovení vazebné kinetiky a koncentrace konjugátu peroxidázy. V experimentech byly maximální hodnoty zaznamenány při pracovním ředění konjugátu 1:3000 při jeho interakci s testovacími séry – 30 minut při teplotě 37 °C.
Při testování citlivosti testovacího systému byla použita různá ředění (od 1:10 do 1:100) krevního séra od pacientů s akutní a chronickou brucelózou, která byla přidána do jamek Ag-v/r senzibilizované destičky. Reakce byla nastavena podle vyvinutých parametrů. Senzitivita detekce specifických protilátek byla hodnocena průměrnou hodnotou CP. Průměrná hodnota CP při ředění séra 1:10 je 2,140±0,129, při ředění séra 1:100 – 2,658±0,221. Počet stupňů volnosti (f) = 13. Párový Studentův t-test = 3689. Kritická hodnota Studentova t-testu pro tento počet stupňů volnosti je 2,16. t obs. >tcrit., změny ve znaku jsou statisticky významné (p<0,05).
Rýže. 3. Závislost hodnot koeficientu pozitivity na ředění séra
Provedené studie umožnily navrhnout diagnostickou reagenční soupravu a diagnostický testovací systém pro detekci protilátek proti původci brucelózy v ELISA (experimentální série). Souprava obsahuje následující součásti: pozitivní kontrola (inaktivovaná) – 1 ampule (0,1 ml); suchý peroxidázový imunoglobulinový konjugát – 1 ampule (0,1 ml); brucelózní mikrobový antigen (polyskupina) v koncentraci 10,0 mg/ml suchá 1 ampule (0,25 ml); fyziologický roztok s fosfátovým pufrem (PBS), suchý vzorek – 1 lahvička; bovinní sérový albumin (BSA), suchý vzorek – 1 lahvička; dvojče 20 – 1 láhev; tetramethylbenzidin (TMB) – 2 lahvičky; 4 N roztok kyseliny sírové (zastavovací činidlo) – 1 lahvička; polystyrénová destička na jedno použití pro ELISA s objemem jamky 0,4 ml – 1 ks; keramický ampulový diskový vertikutátor – 1 ks.
Schopnost testovacího systému detekovat protilátky proti původci brucelózy u různých forem onemocnění byla prokázána v ELISA s 24 séry osob s brucelózou (obrázek 4). Hodnoty CP u akutní formy brucelózy jsou většinou více než 2,0 (aritmetický průměr – 2,86±0,22), u chronické formy jsou hodnoty v rozmezí 1,0 až 2,0 (aritmetický průměr – 1,53±0,10). Hodnoty Studentova t-testu: 5,50. Rozdíly jsou statisticky významné (p<0,05). Počet stupňů volnosti f=23. Kritická hodnota Studentova t-testu = 2,069.
Rýže. 4. Hodnoty CP pro různé formy brucelózy (1–10 – krevní sérum pacientů s chronickou formou brucelózy; 11–24 – krevní sérum pacientů s akutní formou)
Vyvinutý testovací systém umožnil při testování detekovat protilátky proti původci brucelózy u různých forem onemocnění. Současně byla zaznamenána negativní reakce s krevním sérem zdravých lidí.
Na základě provedeného výzkumu byl vyvinut testovací systém pro detekci specifických protilátek proti původci brucelózy na základě metody nepřímé enzymové imunoanalýzy.
Byly stanoveny optimální parametry a podmínky pro nastavení ELISA s vyvinutým testovacím systémem: senzitizace destiček roztokem polyvalentního brucelózního ve vodě rozpustného Ag v 0,1 M PBS, pH 7,2±0,2 s koncentrací proteinu 100 μg/ml po dobu 2 hodin při teplotě 37 °C nebo 1 hodinu v termotřepačce (250 ot./min; 37 °C blokování volných vazebných míst – tlumivým roztokem obsahujícím 0,1 % BSA za přítomnosti neiontového detergentu do 0,05 %; interakce sér se specifickým Ag – 60 min při 37 °C; doba expozice s imunoperoxidázovým konjugátem – 30 min při 37°C.
Výsledkem provedeného výzkumu byl tedy vývoj testovacího systému pro průkaz specifických protilátek proti původci brucelózy, který umožňuje stanovit přítomnost jejich protilátek v krevním séru pacientů s akutní a chronickou brucelózou do 3–4 hodin (včetně předběžné senzibilizace).
Výsledkem testů byla prokázána vysoká aktivita a specificita testovacích systémů pro průkaz specifických protilátek proti původci brucelózy v lidském krevním séru, což umožňuje jejich nabídku jako alternativní test v laboratorní diagnostice brucelózy.